Информация о материале

Статьи

24 апреля 2025

Просмотров: 11

Проект РНФ №22-75-10134 «Эндокринная регуляция сократимости миокарда жировой тканью сердца при фибрилляции предсердий»

Руководитель: Бутова К.А.

2022-2025 гг.

Аннотация:

Жировая ткань сердца (ЖТС) является важным регулятором сократительной функции миокарда. В норме ЖТС секретирует определённый спектр адипокинов и цитокинов. При патологиях, в частности при фибрилляции предсердий (ФП), наблюдается изменение экспрессии от противоспалительных в сторону провоспалительных цитокинов, а также соотношения секреции лептина и адипонектина и других адипокинов. Эти изменения приводят к фиброзу, нарушению проводимости и сократимости миокарда. Кроме того, ЖТС является источником 17β-эстрадиола, который также может играть роль в инициации ФП. Адипокины (лептин и адипонектин) через разные сигнальные каскады участвуют в регуляции экспрессии ароматазы, которая ответственна за синтез 17β-эстрадиола. На сегодняшний день ЖТС рассматривается как маркер кардиоваскулярного риска. Объем ЖТС является предиктором развития ФП.

Таким образом, сократительная функция миокарда предсердий тесно связана с продукцией адипокинов и 17βэстрадиола ЖТС. Роль баланса адипонектина/лептина и 17β-эстрадиола в инициации и развитии ФП остаётся не изученной. Отсутствуют данные о роли адипонектина и лептина в регуляции механической функции предсердий в норме и при ФП. Целью данного проекта является исследование взаимосвязи между содержанием адипонектина/лептина и 17β-эстрадиола, секретируемых ЖТС, и механической активностью предсердий на клеточном и молекулярном уровнях организации миокарда при ФП.

Цель работы – установить влияние адипокинов, лептина и адипонектина, на экспрессию гена ароматазы в ЖТС, то есть на синтез внегонадного 17β-эстрадиола. Выяснить роль лептина, адипонектина, и внегонадного 17β-эстрадиола в регуляции механической активности предсердий в норме и при ФП. Впервые на молекулярном и клеточном уровнях организации миокарда будут проанализированы изменения сократительной функции миокарда предсердий при ФП и при ФП в сочетании с гипоэстрогенией.

Информация о материале

Статьи

22 апреля 2025

Просмотров: 28

Грант РНФ 23-24-00356 "ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КАРДИОМИОЦИТОВ МИОКАРДА ЛЕГОЧНЫХ ВЕН"

Руководитель Щепкин Д.В.

Сокращение миокардиальных рукавов легочных вен играет важную роль в работе сердца, принимая активное участие в наполнении левого предсердия кровью и его расслаблении во время систолы левого желудочка. На крысах было показано, что отсутствие кардиомиоцитов в легочных венах приводит к развитию легочной гипертензии. Вследствие своих анатомических и электрофизиологических свойств миокардиальные рукава вен известны как источник эктопической активности, инициирующей развитие фибрилляции предсердий (ФП). Механизмы возникновения эктопической активности и факторы, поддерживающие эту аномальную электрическую активность, остаются плохо изученными. В частности, слабо исследована сократительная функция кардиомиоцитов миокардиальных рукавов, а между тем их механические свойства могут служить основой для возникновения электрофизиологических аномалий по механизму механоэлектрической обратной связи.

Цель проекта состоит в сравнительном анализе характеристик сокращения одиночных кардиомиоцитов миокардиальных рукавов грудных вен (верхняя полая вена и легочные вены) и кардиомиоцитов левого и правого предсердия, а также выяснении молекулярных особенностей сокращения кардиомиоцитов миокардиальных рукавов грудных вен.

Мы сравнили характеристики сократительной функции одиночных кардиомиоцитов из миокардиальных рукавов верхней полой вены и легочных вен и предсердий морской свинки и проанализировали возможность формирования в миокарде вен механических предпосылок для возникновения эктопических очагов электрической активности. Были получены следующие основные результаты: 1) кардиомиоциты верхней полой вены и легочных вен отличаются между собой временем укорочения и расслабления саркомеров, но не отличаются характеристиками укорочения-расслабления саркомеров от кардиомиоцитов соответствующих предсердий; 2) для кардиомиоцитов миокардиальных рукавов верхней полой вены и легочных вен характерно наличие альтернансов амплитуды укорочения саркомеров и отсутствие корреляции между амплитудой укорочения саркомеров и длиной кардиомиоцитов. Альтернансы амплитуд укорочения саркомеров одиночных кардиомиоцитов могут указывать на возможность формирования неоднородного фронта сократительной активности в ткани миокардиального рукава. 3) При растяжении, кардиомиоциты миокардиальных рукавов верхней полой вены и легочных вен демонстрировали угнетение динамики саркомеров и сократительной способности по сравнению с кардиомиоцитами правого левого предсердия. Таким образом, механические свойства кардиомиоцитов миокардиальных рукавов верхней полой вены и легочных вен могут служить основой для возникновения электрофизиологических аномалий по механизму механоэлектрической обратной связи и быть одной из причин возникновения фибрилляции предсердий.

На молекулярном уровне мы сравнили фосфорилирование белков саркомера и функциональные характеристики сердечного миозина из левого и правого предсердий, верхней полой вены и легочных вен сердца свиньи. Обнаружено, что миозин из миокардиальных рукавов содержит больше β-изоформы тяжелой цепи, то есть характеризуется более медленной кинетикой прикрепления/открепления поперечных мостиков, чем предсердный миозин. В миокардиальных рукавах фосфорилирование тропонина T и I и тропомиозина было ниже, чем в предсердиях. Обнаруженные особенности фосфорилирования белков тонкого филамента крупных животных (свинья) могут влиять на механические характеристики сокращения кардиомиоцитов, а также на механизмы, регулирующие сокращение миокарда, такие как длинозависимая регуляция и механоэлектрическая обратная связь. Механоэлектрическая обратная связь играет важную роль в электрофизиологии сердца, например, изменение механических характеристик миокарда при дилатации предсердий влияет на его электрофизиологические свойства и является причиной аритмий и фибрилляции предсердий.

В результате работы по проекту мы установили ряд молекулярных и механических особенностей сокращения кардиомиоцитов миокардиальных рукавов верхней полой вены и легочных вен, которые могут обусловливать возникновение эктопических очагов электрической активности в предсердиях.

Информация о материале

Статьи

22 апреля 2025

Просмотров: 26

Грант РНФ №22-14-00174 "Влияние точечных мутаций миозин-связывающего белка-С на молекулярные механизмы регуляции мышечного сокращения"

Руководитель Бершицкий С.Ю.

2022-2024 г.

ЕГИСУ НИОКР 122052000090-9

Целью проекта является изучение участия сердечного миозин-связывающего белка С (cMyBP-C) и миозин-связывающего белка С медленных мышц (ssMyBP-C) в молекулярных механизмах регуляции актин-миозинового взаимодействия, влияния точечных мутаций и фосфорилирования на эти механизмы. Для достижения поставленной цели работы велись по нескольким направлением. В результате установлены функциональные особенности N-терминальных фрагментов cMyBP-C, молекулярные механизмы участия мутаций в развитии гипертрофической кардиомиопатии, а также особенности функции изоформ ssMyBP-C.

В N-терминальной части cMyBP-C находятся сайты взаимодействия с белками толстого и тонкого филаментов. Мы сравнили эффекты N-терминальных фрагментов cMyBP-C (C0, C0-С1, C0-C2) на взаимодействие с актином желудочкового и предсердного миозина, используя in vitro подвижную систему (ИПС). Фрагмент С0 не влиял на Са²⁺ зависимость скорости скольжения тонких филаментов по обоим миозинам; фрагмент С0-С1 уменьшал максимальную скорость скольжения филаментов по миозину желудочков; фрагмент С0-С2 уменьшал максимальную скорость и увеличивал Са²⁺ чувствительность скорости скольжения филаментов с миозином желудочков и предсердий.

Известно, что cMyBP-C влияет на количество поперечных мостиков и кинетику прикрепления/открепления миозина от актина, определяя, тем самым, активацию тонких филаментов через механизмы кооперативности. Мы обнаружили, что cMyBP-С увеличивает аффинность желудочкового миозина к АДФ, но уменьшает аффинность предсердного миозина, по-разному влияя на активацию тонкого филамента этими изоформами миозина.

В m-мотиве молекулы cMyBP-C находятся сайты фосфорилирования (Ser275, Ser284 и Ser304), фосфорилирование которых играет важную роль в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Barefeld, Sadayappan, J Mol Cell Cardiol, 2010). Мы исследовали влияние фосфорилирования cMyBP-С с фосфомимикрирующими заменами S304D, S275D/S284D и S284D/S304D и S275D/S284D/S304D на актин-миозиновое взаимодействие. Все варианты фосфорилирования уменьшали Са²⁺ чувствительность актин-миозинового взаимодействия и усиливали мостик-мостиковую кооперативность. С помощью оптической ловушки обнаружено, что фрагмент С0-С2 не влияет на шаг миозина, но увеличивает продолжительность актин-миозинового взаимодействия (Набиев с соавт., Бюлл. эксп. биол. мед. 2024).

Мы исследовали молекулярный механизм развития гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) при мутациях D75N, P161S и L352P cMyBP-C. Обнаружено, что мутации D75N и P161S снижают Са²⁺ чувствительность актин-миозинового взаимодействия, ухудшая активацию тонких филаментов (Kochurova et al.,, Int J of Mol Sci, 2024), а мутация L352P нарушает Са²⁺ регуляцию взаимодействия миозина с актином, приводя к недостаточному ингибированию актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са²⁺. Ранее было показано, что Са²⁺ прямо влияет на функцию cMyBP-C, меняя его структуру (Previs et al., 2016). Мы обнаружили, что Са²⁺ существенно влиянит на функцию cMyBP-C с мутацией L352P.

Идентичность бета-изоформы тяжелых цепей желудочкового миозина и миозина медленных скелетных мышц позволяет использовать волокна этих мышц при изучении молекулярных механизмов развития ГКМП при мутациях белков саркомера. Мы обнаружили, что обе мутации нарушают Са²⁺ регуляцию развития напряжения одиночным волокном и влияют на кинетику развития напряжения, что может вести к диастолической дисфункции сердца и гипертрофии миокарда.

Методом молекулярной динамики (МД) исследовано влияние мутаций D75N и P161S в С0 и С1 доменах, соответственно, на взаимодействие сMyBP-C с актином и тропомиозином (Tpm), используя построенную нами модель комплекса N-концевого участка cMyBP-C с актином и Tpm. Результаты МД указывают на возможное ослабление взаимодействия С0 домена, несущего мутацию D75N, с актином, что было подтверждено экспериментами по связыванию актина фрагментом С0-С2 cMyBP-C. Замена P161S не повлияла на контакты cMyBP-C с актином и Tpm.

Мы исследовали влияния эффекторов функции сердечного миозина, в частности, мавакамтена, на актин-миозиновое взаимодействие при мутациях сMyBP-C. Для экспериментов в ИПС мы использовали L352P мутацию сMyBP-C, которая нарушает ингибирование актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са²⁺. Мы обнаружили, что мавакамтен снижает скорость скольжения тонких филаментов как без фрагментов сMyBP-C, так и при добавлении WT и L352P С0-С2 фрагментов, и ингибирует актин-миозиновое взаимодействие при низких концентрациях Са²⁺ в присутствии L352P С0-С2 фрагмента. Замедление кинетики присоединения поперечных мостиков и ингибирование актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са²⁺ мавакамтеном может снижать гиперсократимость при ГКМП и степень гипертрофии миокарда.

Кроме того, мы исследовали влияние мавакамтена на характеристики сокращения одиночного волокна медленной скелетной мышцы в присутствии фрагмента D75N в С0-С2 cMyBP-C. Мутация D75N была выбрана для этих экспериментов, так как увеличивала Са²⁺ чувствительность силы одиночного волокна, что наблюдается при ГКМП. Мавакамтен снижал максимальное напряжение волокна как без фрагмента D75N С0-С2, так и в его присутствии, а также уменьшал Са²⁺ чувствительность и напряжение при низких концентрациях Са²⁺.

Влияние вариантов Q00872-1, Q00872-5 и Q00872-8 ssMyBP-C на Са²⁺ регуляцию актин-миозинового взаимодействия в скелетных мышцах мы изучали с миозином медленных и быстрых скелетных мышц кролика (m. soleus и m. psoas), так как ssMyBP-C экспрессируется в них обоих. Обнаружены изформ-специфические эффекты вариантов Q00872-1, Q00872-5 и Q00872-8 ssMyBP-C на актин-миозиновое взаимодействие. Варианты Q00872-1 и Q00872-5 уменьшали кальциевую чувствительность напряжения одиночного волокна медленных скелетных мышц, а в концентрации 5 мкМ существенно снижали максимальное изометрическое напряжение и жесткость волокон. Механические и кинетические характеристики волокон оказались более чувствительны к варианту Q00872-5 по сравнению с вариантом Q00872-1.

Информация о материале

Статьи

22 апреля 2025

Просмотров: 33

Грант РНФ №22-24-00729 "Роль тропомодулина и лейомодина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в поперечно-полосатых мышцах"

2022-2023г.

Руководитель: Копылова Г.В.

ЕГИСУ НИОКР 122051100120-5

Корректная сократительная функция миокарда и скелетных мышц требует строго упорядоченной и стабильной структуры саркомера миофибриллы. К основным белкам саркомера, определяющих его стабильность и участвующих в миофибриллогенезе, относятся белки семейства тропомодулинов/лейомодинов (Tmod и Lmod). Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что Tmod и Lmod активируют тонкие нити и таким образом принимают участие в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Ochala et al., FASEB, 2014). Целью Проекта является исследование тропомодулина и лейомодина в качестве новых факторов регуляции актин-миозинового взаимодействия в поперечно-полосатых мышцах.

Исследовано влияние Tmod1 на стабильность актин-тропомиозинового комплекса. Для этого проанализированы температурные зависимости диссоциации Tpm с поверхности актинового филамента в присутствии Tmod1 путем измерения светорассеяния. Обнаружено, что Tmod1 слегка усиливал термостабильность F-актин-тропомиозинового комплекса. С помощью светорассеивания изучено влияние изоформ Tmod1 и Tmod4 на полимеризацию актина в присутствии изоформ тропомиозина Tpm1.1 и Tpm1.2. Добавление обеих изоформ тропомиозина усиливало полимеризацию, уменьшая время полимеризации 50 % белка, что согласуется с ранее полученными данными.

В оптической ловушке измерена изгибная жесткость актин-тропомиозиновых филаментов, реконструированных из актина, тропонинового комплекса и изоформ тропомиозина, в отсутствие изоформ Tmod1, Tmod3 и Tmod4 и при их добавлении. Наличие регуляторных белков тропонина и тропомиозина на актиновой нити увеличивало изгибную жёсткость F-актина, что согласуется с ранее полученными данными (Nabiev et al., Biophysical Journal, 2015). Обнаружено, что изоформы тропомодулина по-разному влияют на изгибную жёсткость тонкой нити, и эффект этот зависит от изоформ тропомиозина. Полученные результаты говорят о том, что взаимодействие разных изоформ тропомодулина с тропомиозином отличается. Ранее было показано, что изоформы Tmod1 и Tmod3 с разной аффинностью связывают изоформы немышечных тропомиозинов и альфа-тропомиозин (Yamashiro et al., The Journal of biological chemistry, 2014). Аминокислотная последовательность N-терминальной части изоформ Tmod1 и Tmod4 имеет значительные отличия (Greenfield et al., Biophysical Journal, 2005), что определяет особенности взаимодействия тропомодулина с тропомиозином.

Используя in vitro подвижную систему (ИПС), исследовано влияние изоформ Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в миокарде, а также быстрых и медленных скелетных мышцах. Для исследования влияния Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в миокарде использовали сердечный миозин из левого предсердия и желудочка овцы, Tpm1.1 и Tpm1.2 человека, а также сердечный тропониновый комплекс человека. В саркомере миокарда экспрессируется Tmod1, поэтому мы исследовали его влияние на взаимодействие сердечных белков. В некоторых экспериментах мы сравнили эффекты Tmod1 и Tmod4, использовав последний в качестве модели тропомодулина с другой аминокислотной последовательностью сайтов связывания тропомозина.

В быстрых и медленных скелетных мышцах экспрессируется специфический спектр изоформ миозина, тропонина и тропомиозина. Поэтому для исследования влияния Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в медленных мышцах мы использовали миозин и тропониновый комплекс, выделенные из медленной скелетной (m. soleus) мышцы кролика, с Tpm3.12, а также с гетеродимером Tpm2.2/Tpm3.12; а в быстрых мышцах – миозин и тропониновый комплекс, выделанные из быстрой скелетной мышцы (m. psoas) кролика, с Tpm1.1 и Tpm3.12. В саркомере скелетных мышц экспрессируются Tmod1 и Tmod4, а при нокауте гена TMOD1 вместо Tmod1 экспрессировались Tmod3 и Tmod4 (Ochala et al., FASEB, 2014). Поэтому мы сравнили влияние Tmod1, Tmod3 и Tmod4 на актин-миозиновое взаимодействие в скелетных мышцах.

Для оценки влияния Tmod на скорость скольжения актинового филамента измерили скорость F-актина при концентрациях Tmod от 50 нМ до 1000 нМ. Обнаружено, что тропомодулин не влияет на скорость скольжения F-актина по миозину в ИПС, что говорит об отсутствии его неспецифического взаимодействия с актином. Влияние Tmod на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия изучали, анализируя кальциевую зависимость скорости скольжения регулируемых тонких филаментов, реконструированных из актина, тропонина и тропомиозина, по миозину в ИПС (зависимость рСа-скорость). Для исследования влияния Tmod на активацию тонких филаментов поперечными мостиками миозина (мостик-мостиковая кооперативность) проанализирована зависимость скорости скольжения филаментов от концентрации миозина, загружаемого в проточную ячейку.

Обнаружено, что изоформы Tmod по-разному активируют тонкий филамент через механизм мостик-мостиковой кооперативности и влияют на характеристики взаимодействия изоформ сердечного и скелетного миозина с актином, а также на параметры кальциевой регуляции этого взаимодействия (максимальную скорость скольжения тонких филаментов и кальциевую чувствительность актин-миозинового взаимодействия).  Эффекты Tmod на характеристики кальциевой регуляции актин-миозинового взаимодействия зависели также от изоформ тропомиозина.

В результате выполнения Проекта удалось установить особенности взаимодействия изоформ Tmod с актином и тропомиозином в сердечной и скелетной мышцах. Полученные результаты однозначно указывают на участие тропомодулина в активации тонких филаментов как в скелетных мышцах, так и миокарде, и позволяют сделать вывод о том, что тропомодулин относится к регуляторной системе тонких филаментов. Кроме того, результаты экспериментов с миокардиальными белками крысы говорят о том, что тропомодулин участвует в молекулярных механизмах адаптации сократительной функции сердца у млекопитающих с разной частотой сердечных сокращений.