Грант РНФ №22-14-00174 "Влияние точечных мутаций миозин-связывающего белка-С на молекулярные механизмы регуляции мышечного сокращения"
Руководитель Бершицкий С.Ю.
2022-2024 г.
ЕГИСУ НИОКР 122052000090-9
Целью проекта является изучение участия сердечного миозин-связывающего белка С (cMyBP-C) и миозин-связывающего белка С медленных мышц (ssMyBP-C) в молекулярных механизмах регуляции актин-миозинового взаимодействия, влияния точечных мутаций и фосфорилирования на эти механизмы. Для достижения поставленной цели работы велись по нескольким направлением. В результате установлены функциональные особенности N-терминальных фрагментов cMyBP-C, молекулярные механизмы участия мутаций в развитии гипертрофической кардиомиопатии, а также особенности функции изоформ ssMyBP-C.
В N-терминальной части cMyBP-C находятся сайты взаимодействия с белками толстого и тонкого филаментов. Мы сравнили эффекты N-терминальных фрагментов cMyBP-C (C0, C0-С1, C0-C2) на взаимодействие с актином желудочкового и предсердного миозина, используя in vitro подвижную систему (ИПС). Фрагмент С0 не влиял на Са2+ зависимость скорости скольжения тонких филаментов по обоим миозинам; фрагмент С0-С1 уменьшал максимальную скорость скольжения филаментов по миозину желудочков; фрагмент С0-С2 уменьшал максимальную скорость и увеличивал Са2+ чувствительность скорости скольжения филаментов с миозином желудочков и предсердий.
Известно, что cMyBP-C влияет на количество поперечных мостиков и кинетику прикрепления/открепления миозина от актина, определяя, тем самым, активацию тонких филаментов через механизмы кооперативности. Мы обнаружили, что cMyBP-С увеличивает аффинность желудочкового миозина к АДФ, но уменьшает аффинность предсердного миозина, по-разному влияя на активацию тонкого филамента этими изоформами миозина.
В m-мотиве молекулы cMyBP-C находятся сайты фосфорилирования (Ser275, Ser284 и Ser304), фосфорилирование которых играет важную роль в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Barefeld, Sadayappan, J Mol Cell Cardiol, 2010). Мы исследовали влияние фосфорилирования cMyBP-С с фосфомимикрирующими заменами S304D, S275D/S284D и S284D/S304D и S275D/S284D/S304D на актин-миозиновое взаимодействие. Все варианты фосфорилирования уменьшали Са2+ чувствительность актин-миозинового взаимодействия и усиливали мостик-мостиковую кооперативность. С помощью оптической ловушки обнаружено, что фрагмент С0-С2 не влияет на шаг миозина, но увеличивает продолжительность актин-миозинового взаимодействия (Набиев с соавт., Бюлл. эксп. биол. мед. 2024).
Мы исследовали молекулярный механизм развития гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) при мутациях D75N, P161S и L352P cMyBP-C. Обнаружено, что мутации D75N и P161S снижают Са2+ чувствительность актин-миозинового взаимодействия, ухудшая активацию тонких филаментов (Kochurova et al.,, Int J of Mol Sci, 2024), а мутация L352P нарушает Са2+ регуляцию взаимодействия миозина с актином, приводя к недостаточному ингибированию актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са2+. Ранее было показано, что Са2+ прямо влияет на функцию cMyBP-C, меняя его структуру (Previs et al., 2016). Мы обнаружили, что Са2+ существенно влиянит на функцию cMyBP-C с мутацией L352P.
Идентичность бета-изоформы тяжелых цепей желудочкового миозина и миозина медленных скелетных мышц позволяет использовать волокна этих мышц при изучении молекулярных механизмов развития ГКМП при мутациях белков саркомера. Мы обнаружили, что обе мутации нарушают Са2+ регуляцию развития напряжения одиночным волокном и влияют на кинетику развития напряжения, что может вести к диастолической дисфункции сердца и гипертрофии миокарда.
Методом молекулярной динамики (МД) исследовано влияние мутаций D75N и P161S в С0 и С1 доменах, соответственно, на взаимодействие сMyBP-C с актином и тропомиозином (Tpm), используя построенную нами модель комплекса N-концевого участка cMyBP-C с актином и Tpm. Результаты МД указывают на возможное ослабление взаимодействия С0 домена, несущего мутацию D75N, с актином, что было подтверждено экспериментами по связыванию актина фрагментом С0-С2 cMyBP-C. Замена P161S не повлияла на контакты cMyBP-C с актином и Tpm.
Мы исследовали влияния эффекторов функции сердечного миозина, в частности, мавакамтена, на актин-миозиновое взаимодействие при мутациях сMyBP-C. Для экспериментов в ИПС мы использовали L352P мутацию сMyBP-C, которая нарушает ингибирование актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са2+. Мы обнаружили, что мавакамтен снижает скорость скольжения тонких филаментов как без фрагментов сMyBP-C, так и при добавлении WT и L352P С0-С2 фрагментов, и ингибирует актин-миозиновое взаимодействие при низких концентрациях Са2+ в присутствии L352P С0-С2 фрагмента. Замедление кинетики присоединения поперечных мостиков и ингибирование актин-миозинового взаимодействия при низких концентрациях Са2+ мавакамтеном может снижать гиперсократимость при ГКМП и степень гипертрофии миокарда.
Кроме того, мы исследовали влияние мавакамтена на характеристики сокращения одиночного волокна медленной скелетной мышцы в присутствии фрагмента D75N в С0-С2 cMyBP-C. Мутация D75N была выбрана для этих экспериментов, так как увеличивала Са2+ чувствительность силы одиночного волокна, что наблюдается при ГКМП. Мавакамтен снижал максимальное напряжение волокна как без фрагмента D75N С0-С2, так и в его присутствии, а также уменьшал Са2+ чувствительность и напряжение при низких концентрациях Са2+.
Влияние вариантов Q00872-1, Q00872-5 и Q00872-8 ssMyBP-C на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия в скелетных мышцах мы изучали с миозином медленных и быстрых скелетных мышц кролика (m. soleus и m. psoas), так как ssMyBP-C экспрессируется в них обоих. Обнаружены изформ-специфические эффекты вариантов Q00872-1, Q00872-5 и Q00872-8 ssMyBP-C на актин-миозиновое взаимодействие. Варианты Q00872-1 и Q00872-5 уменьшали кальциевую чувствительность напряжения одиночного волокна медленных скелетных мышц, а в концентрации 5 мкМ существенно снижали максимальное изометрическое напряжение и жесткость волокон. Механические и кинетические характеристики волокон оказались более чувствительны к варианту Q00872-5 по сравнению с вариантом Q00872-1.