Научный микроблог

Brazhnikov, A., Zotova, N., Solomatina, L., Sarapultsev, A., Spirin, A., & Gusev, E. (2023). Shock-Associated Systemic Inflammation in Amniotic Fluid Embolism, Complicated by Clinical Death. Pathophysiology, 30(1), 48-62.

https://doi.org/10.3390/pathophysiology30010006

История вопроса: Эмболия амниотической жидкостью (ЭАЖ) является одной из основных причин материнской смертности в развитых странах. Наиболее критические варианты ЭАЖ могут быть рассмотрены с точки зрения системного воспаления (СВ) - общего патологического процесса, включающего высокий уровень системного воспалительного ответа, нарушение нейроэндокринной системы, микротромбоз и синдром полиорганной недостаточности (СПОН). Целью данной работы было охарактеризовать динамику сверхострого СВ на примере четырех клинических случаев пациентов с критической ЭАЖ.

Методы: Во всех случаях мы исследовали параметры свертывания крови, уровень кортизола, тропонина I, миоглобина, С-реактивного белка, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-α в плазме крови и рассчитывали интегральные показатели.

Результаты: У всех четырех пациентов были выявлены характерные признаки СВ, включая повышение уровня цитокинов, миоглобина и тропонина I, изменения кортизола крови, клинические проявления коагулопатии и СПОН. При этом уровень цитокинов в плазме крови можно охарактеризовать не только как гиперцитокинемию, и даже не как "цитокиновый шторм", а скорее как "цитокиновую катастрофу" (повышение в тысячи и десятки тысяч раз уровня провоспалительных цитокинов). Патогенез ЭАЖ включает в себя быстрый переход от гиперэргической фазы шока с высоким уровнем системного воспалительного ответа к гипоэргической фазе шока, характеризующейся несоответствием между низкими значениями системного воспалительного ответа и критическим состоянием пациента. В отличие от септического шока, при ЭАЖ наблюдается гораздо более быстрая смена фаз СВ.

Заключение: ЭАЖ является одним из наиболее убедительных примеров для изучения динамики сверхострого СВ.

Типовые патогенетические изменения исследуемых случаев представлены на рисунках ниже.

Чешуйки эпидермиса плода в сосудах лёгкого матери.Стрелка указывает на фетальные сквамозные клетки в просвете сосуда (окраска гематоксилином и эозином, увеличение x100).

ДВС-синдром -  фибриновые сгустки в сосудах микроциркуляторного русла лёгких матери.Стрелки указывают на сгустки фибрина в легочных сосудах (окраска гематоксилином и эозином, увеличение x100).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РФФИ №20-31-90106 (рук. Волжанинов Д.А.)

При помощи уникальной экспериментальной методики карбоновых волокон в первый год проекта была исследована длинозависимая регуляция сократимости (закон Франка-Старлинга) кардиомиоцитов свободной стенки левого и правого желудочков и межжелудочковой перегородки взрослых самцов и самок крыс линии Wistar. Обнаружено, что кардиомиоциты правого желудочка демонстрируют больший индекс сократимости по сравнению с кардиомиоцитами межжелудочковой перегородки как в группе самцов, так и в группе самок. Анализ гендерных (половых) отличий механической функции кардиомиоцитов показал, что кардиомиоциты правого желудочка группы самок демонстрируют больший индекс сократимости по сравнению с кардиомиоцитами правого желудочка группы самцов.

При помощи оригинальной математической модели электромеханического сопряжения в желудочковых кардиомиоцитах, ранее разработанной в ИИФ УрО РАН, были воспроизведены основные физиологические феномены, обнаруженные экспериментально в группе самцов крыс линии Wistar.

В рамках задачи по исследованию грузозависимой регуляции механической функции клетки в экспериментальный программно-аппаратный комплекс, использующий методику карбоновых волокон, был внедрен контур обратной связи с использованием приборов, работающих в реальном времени, и реализованы различные режимы сокращения (изометрический, изотонический, ауксотонический) одиночных кардиомиоцитов в физиологическом эксперименте. Была исследована грузозависимая регуляция сократимости кардиомиоцитов свободной стенки левого и правого желудочков и межжелудочковой перегородки взрослых самцов и самок крыс линии Wistar. Обнаружено, что кардиомиоциты левого желудочка демонстрируют большую чувствительность к изменению режима сокращения, чем кардиомиоциты правого желудочка. Для сравнения временных профилей сокращения при различных режимах сокращения была успешна апробирована методика оценки эластанса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗА 2022 ГОД ПО ПРОЕКТУ РНФ №21-14-00226 (рук. Кацнельсон Л.Б.)

В 2022 году продолжалась работа, направленная на изучение роли пограничной ишемической зоны в аритмогенезе. Исследования были проведены на крысах и свиньях in vivo, а также на изолированных кардиомиоцитах желудочков животных обоих видов. Изучались возможные механизмы изменений в пограничной зоне и электрокардиографическое отображение этих изменений. Проведённая экспериментальная работа показала 1) в формировании пограничной ишемической зоны значительную роль играет внеклеточный калий; 2) механизм электрофизиологических изменений в пограничной области связан с АТФ-зависимым калиевым током; 3) ранние изменения в пограничной области отображаются на ЭКГ в виде изменения длительности интервала QT.

На основании собственных экспериментальных исследований и данных литературы, разработана математическая модель генерации ЭКГ свиньи при развитии ишемии миокарда. На ней проверены сценарии возникновения ранних и задержанных ишемических фибрилляций желудочков и определены электрокардиографические предикторы этих аритмий.

Интегративные электро-механо-метаболические математические модели кардиомиоцитов желудочка сердца человека и крысы использованы для имитации разных факторов проявления ишемии в изометрических сокращениях и при физиологическом режиме нагрузок. Получено характерное укорочение длительности потенциала действия кардиомиоцита, наблюдаемое при развитии гипоксических нарушений и гиперкалиемии, проанализирован вклад эффектов ацидоза, возникающего при ишемии, а также эффектов ишемии, связанных с ослаблением активности кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума, натрий-калиевой АТФазы и выходящего калиевого тока.

Проведены эксперименты на 1D моделях сердечной ткани крысы и человека, учитывающих участки ишемизированной ткани разного объёма и разное направление волны возбуждения. Показано, с увеличением размера ишемизированного участка образца миокарда не только сильнее падает генерируемая сила, но и увеличивается дисперсия реполяризации клеток образца. В 1D модели миокарда человека найдены условия возникновения спонтанной электрической активности и блока проведения волны возбуждения в ишемизированном миокарде.

Построены 2D модели для дальнейшего изучения взаимодействия ишемизированных и неишемизированных участков миокарда и сравнения с экспериментальными данными, получаемыми в проекте, после обработки методами визуализации изображений.

Разработаны геометрические трёхмерные модели целого сердца свиньи, включающие ишемизированную и пограничную зону, положение которых соответствует их положению в сердцах свиней, используемых в экспериментах.

Разработана схема неконтролируемой глубокой нейронной сети преобразования пиксельной текстуры изображения для получения качественных паттернов поля деформаций миокарда с помощью кросс-корреляционного анализа. Были обработаны кадры видеозаписей, полученные в экспериментах на открытом сердце свиньи (Рис. 1А, Б). Получены паттерны деформации нескольких участков эпикарда на разных этапах эксперимента, предшествующих возникновению фибрилляций: до окклюзии коронарной артерии и на нескольких временных интервалах после. Визуализирована динамика механических спиральных волн на протяжении нескольких миллисекунд (Рис. 1Е).Рис. 1. Анализ механоэлектрического взаимодействия в ишемизированном миокарде. А, Б: Кадры, показывающие эпикардиальные отведения, расположенные в узлах резиновой сетки (пронумерованы). В их окрестностях (круги) проводился анализ векторов деформаций (В), для которых затем определяли модуль (Vector modulus) и угол (COD angle) (Г). Последние были сопоставлены с электрофизиологическими показателями, определёнными в эпикардиальных отведениях – время активации (АТ); длительность (ARI) и время окончания (RT) реполяризации (Д). Как электрофизиологические, так и механические параметры проявляют характерную динамику на протяжении первых 20 минут окклюзии, однако ассоциаций между изученными параметрами выявлено не было. Е: Стримлайновые графики для полей деформации эпикарда во время фибрилляции, демонстрирующие динамику механической спиральной волны, показанные с применением разработанного метода улучшения кросс-корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РФФИ №21-54-15001-НЦНИ_а рук. Лукин О.Н.

Сердце – орган с отчетливой структурно-функциональной неоднородностью составляющих его кардиомиоцитов. Характеристики и свойства миоцитов зависят от их пространственной локализации: например, миоциты внутреннего (субэндокардиального) слоя стенки сердца возбуждаются раньше, а сокращаются медленнее и сильнее, чем миоциты внешнего (субэпикардиального) слоя. Согласованное в пространстве и во времени сокращение миллионов неодинаковых по своим свойствам кардиомиоцитов обеспечивает функционально однородное сокращение целого сердца. Поэтому феномен неоднородности миокарда считается одним из важнейших в регуляции работы сердца.

Феномен неоднородности имеет иерархическую структуру: межкамерная неоднородность (предсердия тоньше и слабее, чем желудочки), на уровне стенки камеры (трансмуральная неоднородность), на уровне одного мышечного слоя (неоднородность свойств миоцитов вдоль хода мышечного волокна), на уровне субмиллиметровых сегментов сердечной ткани (межклеточная неоднородность). Логически вытекающий внутриклеточный уровень неоднородности (внутри одного миоцита) изучен наименее всего; пока этот уровень не рассматривается в иерархии феномена неоднородности.

Сердце выполняет механическую (насосную) функцию, поэтому его эффективная работа зависит от сократимости миоцитов. Сокращение миоцита инициируется электрическим возбуждением, высвобождением ионов кальция из внутриклеточных депо (саркоплазматический ретикулум) в цитозоль клетки и взаимодействием этого кальция с белками элементарных сократительных структур – саркомеров. Последовательность этих событий и внутриклеточные механизмы, обеспечивающие эти события, называются электромеханическим сопряжением. Ключевые компоненты электромеханического сопряжения – длина саркомера, внутриклеточный кальциевый цикл, тубулярная система саркоплазматической мембраны (Рисунок 1). В нашем проекте мы изучаем неоднородность характеристик этих компонентов на уровне одиночного кардиомиоцита (внутриклеточная неоднородность) в аспекте роли этой неоднородности в проявлении иерархически более высокого уровня трансмуральной неоднородности (от субэпи- к субэндокардиальному слою стенки сердца).

Рисунок 1. Компоненты электро-механического сопряжения в кардиомиоцитах, исследуемые в рамках проекта.

В отчетном периоде мы оценивали характер неоднородности длин саркомеров (Рисунок 2) в изолированных кардиомиоцитах субэпи- и субэндокардиальных слоев стенки левого желудочка морских свинок. Мы впервые оценили вариабельность длин саркомеров в двух принципиально различных сократительных состояниях миоцита – невозбужденном («диастола») и при максимальном его сокращении («систола»). По сравнению с «диастолой», в «систолу» распределение длин саркомеров в значительно меньшей степени подчиняется нормальному (гауссовому) закону, а степень вариабельности растет (Рисунок 2). Эти изменения в вариабельности длин саркомеров при переходе миоцита из «диастолы» в «систолу» не имели трансмуральных различий (между субэндо- и субэпикардиальными миоцитами) или различий между двумя регионами в пределах одного и того же миоцита (центральным и периферическим). Для определения длин саркомеров и оценки их вариабельности был разработан оригинальный алгоритм с возможностью настройки его параметров в рамках уникального программного обеспечения. В контексте задач, требующих знания о степени вариабельности длин саркомеров, полученных для изображений миоцитов в проходящем свете или для флюоресцентно окрашенных миоцитов, это программное обеспечение предоставляет широкие возможности.

Рисунок 2. Для получения данных о неоднородности длин саркомеров использовались изолированные кардиомиоциты; измерения выполнялись в двух принципиально различных состояниях активации миоцита – невозбужденном («диастола») и при его максимальном сокращении («систола»).

Полученные в ходе первого этапа результаты указывают на физиологическое значение внутриклеточной неоднородности длин саркомеров и на ее непосредственную связь с функциональным состоянием миоцита. Это подтверждает предположение, что неоднородность на внутриклеточном уровне играет важную роль в обеспечении интегральной сократительной функции миоцита и является минимальным уровнем в иерархии неоднородности миокарда. Для выявления механизмов этого феномена и его возможного вклада в неоднородность сократительных свойств кардиомиоцитов на более высоком уровне (межклеточном, тканевом, трансмуральном) требуется проведение дальнейших экспериментов. На втором этапе проекта будет изучаться взаимосвязь между вариабельностью длин саркомеров и неоднородностями локальных кальциевых циклов в этих саркомерах, в том числе в условиях физиологически релевантной механической нагрузки на изолированный кардиомиоцит.

Результат исследований по проекту РНФ № 19-14-00134 рук. д.ф.-м.н., проф. О.Э. Соловьева

Разработана и реализована в виде пакета компьютерных программ технология построения и расчета персонифицированных моделей электрической активности желудочков сердца человека (рис. 1).

Рисунок 1. Этапы создания электрофизиологических моделей: 1. Сегментация данных компьютерной томографии (КТ). 2. Создание конечно-элементной персонифицированной геометрии. Желтым цветом обозначены легкие, красным - сердце. 3. Расчет электрофизиологического возбуждения в сердце: А. Выделение геометрии сердца; В. Задание поля миокардиальных волокон; С Расчет карты активации. Звездочки обозначают местоположения виртуальных стимулирующих электродов, красная область - постинфарктный рубец. 4. Расчет карты потенциалов на поверхности торса. 5. Расчет сигналов ЭКГ.

В ходе решения задачи построения персонифицированных моделей нами проведено обширное биофизическое исследование и получены новые значимые результаты. Усовершенствован и реализован метод универсальных координат, обеспечивающий масштабирование геометрических параметров моделей, возможность сравнения моделей друг с другом. Проведен анализ чувствительности модели к различным параметрам модели. Найдены наиболее значимые параметры, варьирование которых в наибольшей степени влияет на характеристики ЭКГ [1]. В рамках проекта разработаны алгоритмы оптимизации параметров проводимости на основе данных ЭКГ пациентов различными методами и проведено их сравнение [2].

На основе собранных клинических данных при помощи разработанных инструментов построения персонифицированных моделей в рамках проекта создана уникальная, самая большая на сегодняшний день в мире коллекция (n=62) пациент-специфических биофизических моделей желудочков сердца пациентов с ХСН, учитывающих морфометрические характеристики левого желудочка; степень тяжести и локализацию фиброзных и постинфарктных изменений миокарда; особенности нарушения проведения по системе Гиса-Пуркинье; индивидуальные характеристики ЭКГ пациента, характер диссинхронии желудочков; а также локализацию электродов кардиостимулятора и параметры программирования устройств СРТ. Эта популяция персонифицированных моделей позволила нам провести серию виртуальных клинических исследований, на основе которых нам удалось при помощи методов машинного обучения разработать прогностическую модель (классификатор) успешности проведения СРТ, значительно повышающую точность предсказания по сравнению с существующими клиническими рекомендациями и другими прогностическими моделями, основанными на клинических данных [3, 4, 5].

В данном проекте мы впервые разработали принципиально новый подход, заключающийся в использовании комбинированных клинических и модельных данных для прогноза успешности СРТ. Наряду с имеющимися дооперационными клиническими данными пациентов мы использовали результаты расчетов персонифицированных моделей электрической активности желудочков сердца в качестве in-silico предсказаний результативности виртуальной стимуляции желудочков для конкретного пациента, которые можно получить до имплантации ему устройств. Впервые объединенный гибридный набор реальных и расчетных данных был нами использован для обучения модели классификации респондеров и нереспондеров на терапию. В результате нам удалось увеличить точность дооперационного прогноза вероятности успеха СРТ до 80%, что значительно (более чем на 10%) превышает точность существующих моделей прогноза, основанных только на клинических данных, включая действующие клинические рекомендации [3].

Ссылки

1. Ushenin K., Kalinin V., Gitinova S., Sopov O., Solovyova O. Parameter variations in personalized electrophysiological models of human heart ventricles // Plos One. 2021. 16(4): e0249062. IF(2020)=3.24, Q1 SRJ, WOS  SCOPUS
2. Bazhutina A.E., Dokuchaev A.D.,  Khamzin S.Yu., Zubarev S., Solovyova O. Comparison of CRT Optimization Results for Different Accuracy Personalized Models // 2021 IEEE Ural-Siberian Conference on Computational Technologies in Cognitive Science, Genomics and Biomedicine (CSGB), 2021, pp. 420-424. doi: 10.1109/CSGB53040.2021.9496023, Scopus
3. Khamzin S., Dokuchaev A., Bazhutina A., Chumarnaya T., Zubarev S., Lyubimtseva T., Lebedeva V., Lebedev D., Gurev V.,  Solovyova O. Machine Learning prediction of cardiac resynchronisation therapy response from combination of clinical and model-driven data // Frontiers in Physiology. ‒ 2021. ‒ V. 12. ‒ № 2283. DOI: 10.3389/fphys.2021.753282 , IF(2020) =4.566, Q1 WoS, Scopus
4. Rokeakh R., Bazhutina A., Khamzin S., Dokuchaev A., Chumarnaya T., Zubarev S., Lyubimtseva T., Lebedeva V., Lebedev D., Solovyova O. Combination of clinical data and personalized ventricular model simulations for cardiac resynchronization therapy outcome prediction //  Heart Rhythm, Vol. 18, No. 8, August Supplement 2021, B-PO05-009, pp. S374-S375. doi: 10.1016/j.hrthm.2021.06.929, IF(2020)=6.343, Q1 WoS, Scopus
5. Rokeakh R., Bazhutina A., Khamzin S., Dokuchaev A., Chumarnaya T., Zubarev S., Lyubimtseva T., Lebedeva V., Lebedev D., Solovyova O. Predicting CRT outcome by combining markers from personalized ventricular models of electrophysiology and clinical data // European Heart Journal. 2021. . 42, Issue Supplement_1, October 2021, ehab724.0710 doi: 10.1093/eurheartj/ehab724.0710, IF(2020)=29.983, Q1WoS, Scopus

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РНФ №19-14-00134 (рук. Соловьева О.Э.)

1. На основе сегментации данных МРТ с отсроченным контрастированием построены 26 детализированных моделей миокардиального фиброза и интегрированы в персонифицированные геометрические модели желудочков. Показано, что точность детализации фиброза влияет на его объемные характеристики и частоту встречаемости сегментов желудочка с фиброзными включениями. Вместе с тем средние электрофизиологические характеристики диссинхронии активации миокарда значимо не отличаются в моделях с различной точностью описания фиброза и при собственный ритме с БЛНПГ, и при бивентрикулярной (БиВ) стимуляции желудочков. Результаты говорят в пользу возможности использования относительно грубых оценок положения и размеров фиброза для прогнозирования эффектов стимуляции желудочков.

2. Разработана усовершенствованная модель проводящей системы Гиса-Пуркинье. Для каждой из построенных нами 57 анатомических моделей желудочков протестировано несколько конфигураций левой и правой ножек пучка Гиса (ЛНПГ и ПНПГ): 10 моделей ПНПГ; 10 -- ЛНПГ с удаленной передней ветвью; 10 -- ЛНПГ с удаленной задней ветвью; 10 -- ЛНПГ без обеих ветвей; 10 моделей с несколькими уровнями блокады проводящей системы от дистального до проксимального блокада ЛНПГ. На основе результатов моделирования построена прогностическая модель, предсказывающая уровень БЛНПГ на основе значений индексов диссинхронии активации. Наиболее значимыми предикторами уровня блокады оказались полное время активации желудочков, ширина QRS комплекса.

3. Разработано 19 интегративных моделей, включающих данные о фиброзе, анатомии вен коронарного синуса и желудочков. С помощью разработанного нами ранее классификатора ответа на СРТ, обученного на клинических данных и результатах персонифицированного моделирования, протестирована зависимость оценки вероятности ответа на СРТ от выбора положения ЛЖ стимулирующего электрода в доступных венах коронарного синуса. Показано, что ML балл классификатора, дающий оценку вероятности успеха СРТ, может существенно изменяться при варьировании позиции электрода в целевых венах.

Рис. 1 Примеры построенных по клиническим данным интегративных моделей желудочков сердца, коронарного синуса и реалистичного фиброза. Зелеными точками отмечены стимулирующие ЛЖ и ПЖ электроды, установленные в клинике при имплантации устройств СРТ. Цветными красно-синими точками обозначены доступные положения для установки ЛЖ электрода  в венах коронарного синуса. Бордовым цветом отмечен фиброз, построенный на основе сегментации МРТ изображений. Черными точками отмечены доступные для стимуляции точки вен коронарного синуса, у которых ML балл больше 0.8, красным отмечены точки с максимальным ML баллом.

 

4. Собраны и проанализированы клинические данные стандартного протокола ЭХОКГ и видео-записей изображений сердца в течение сердечного цикла у пациентов контрольной группы без сердечно-сосудистой патологии (n=34) и группы пациентов с ХСН, кандидатов на СРТ до (n=30) и после  (n=23) имплантации устройств СРТ. Разработан новый метод морфометрического анализа динамики изменения формы ЛЖ в течение сердечного цикла в пространстве форм и пространстве траекторий. Показано, что морфометрические параметры значимо отличаются в контрольной группе и у пациентов с ХСН, ряд характеристик обладают прогностической значимостью и входят в классификаторы, со 100% точностью разделяющие норму и патологию. С помощью логистической регрессии на параметрах морфометрического анализа построен классификатор острого ответа на СРТ, определяемого по > 10% снижению конечно-систолического объема ЛЖ. Точность классификатора составила 87% (чувствительность 86% и специфичность 89%).

5. Новые результаты моделирования, полученные в рамках усовершенствованных моделей желудочков с детализированным описанием зон фиброза (п.1), были использованы для построения усовершенствованных классификаторов ответа на СРТ, прогнозирующих вероятность улучшения фракции выброса ЛЖ на 10% и более. Мы выяснили, что хотя расстояние от ЛЖ электрода до зоны фиброза (зависит от точности представления фиброза) является одним из наиболее значимых признаков в предсказательной модели, точность классификатора ответа на СРТ и его результаты практически не изменяются при обучении на данных с сегментированной зоной фиброза по сравнению с классификатором, обученном на результатах упрощенных моделей. Разница в точности классификаторов составляет всего 0.5%. Этот результат поддерживает гипотезу о возможности использовать упрощенные модели фиброза для надежного предсказания эффективности СРТ при отборе пациентов и планировании процедуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РФФИ № 20-44-660003 р_а (рук. Проценко Ю.Л.)

Одной из важных и интересных проблем современной науки является поиск и разработка новых лекарств. В нашей работе мы исследовали действие препарата, первоначально носившего индекс СК1827452, а затем, название Omecamtiv mecarbil (ОМ). Он позиционировался как селективный активатор сердечного миозина, т.е. препарат для инотропной поддержки при систолической сердечной недостаточности и непосредственно нацеленный на увеличение силы сокращений в сердечных клетках без влияния на кинетику кальция в кардиомиоцитах. Дело в том, что сердечная недостаточность является ведущей причиной смертности с прогрессивно растущей распространенностью. Ее современная терапия основана на комбинации блокаторов β-рецепторов, ингибиторов АПФ и диуретиков. Этот ограниченный терапевтический подход в основном обусловлен известными побочными эффектами доступных в настоящее время инотропных агентов, включая агонисты β-рецепторов и ингибиторы фосфодиэстеразы. В этих случаях существует два основных источника побочных эффектов: повышенная цитозольная концентрация Ca2+ и повышенная потребность сердца в кислороде - оба, как известно, сильно проаритмичны [Nánási et al. 2017].

Современные достижения в области кристаллографии, спектроскопии и вычислительной биофизики позволяют создавать огромные базы данных различных структур химических соединений. Одним из методов поиска новых лекарственных соединений является метод высокопроизводительного скрининга, или перебора. Суть этого метода заключается в том, что с использованием суперкомпьютеров происходит перебор большого количества соединений из баз данных и отбор тех, которые наилучшим образом соединяются с нужным белком-мишенью клетки. Поскольку биохимические процессы в живых тканях находятся в сложных взаимосвязанных отношениях между собой, то очень сложно предсказать ответную реакцию на новое вещество и его поведение в организме. Для этого используют комбинированный вычислительно-экспериментальный подход,  который служит платформой для установления различий в клеточной активности кандидатов со схожими функциональными профилями, тем самым, упрощая идентификацию кандидатов, подобных лекарствам, сначала на животных.

Наша работа выполнена на многоклеточных препаратах миокарда изолированных из сердца крыс. Преимущество такого подхода состоит в том, что с одной стороны, препарат сохраняет все основные морфологические структуры миокарда, с другой, исключается влияние различных гуморальных и нервных факторов целого организма. Кроме того, в эксперименте для установления механизма действия вещества можно использовать широкий диапазон дозировки нового фармакологического соединения и в большом спектре внешних условий (температура, частота сердцебиений и т.д.). Целью работы было экспериментально установить дозо-зависимые эффекты ОМ при разных концентрациях ионов кальция в растворе на основные механизмы регуляции сократимости миокарда здоровых животных и животных с монокроталиновой моделью легочно-сердечной недостаточностью. Регистрировали механическую активность изолированных биоптатов миокарда правого желудочка сердца в изометрическом режиме и кинетику ионов кальция в кардиомиоцитах (внутриклеточные кальциевые переходы). Температура растворов 30 — 35º С, частота стимуляции 2 Гц.

Рис. 1. Суперпозиции нормированных на свою амплитуду сокращений (A) и кальциевых переходов (B) трабекул крыс из группы с легочно-сердечной недостаточностью без OM и при действии омекамтива 1.0 мкМоль/л в растворе К-Х с концентрацией кальция 2.0 мМоль/л на длине растяжения 0.95 Lmax. Частота стимуляции 2 Гц и температура раствора 30°C.

В изометрическом режиме впервые показано, что положительный инотропный эффект ОМ сильнее проявляется в препаратах миокарда больных крыс, чем здоровых и на малых длинах растяжения миокарда, чем на больших. В соответствие с известным феноменом Франка-Старлинга, это соответствует меньшим величинам конечно-диастолического объема. Вопреки анонсированному невмешательству ОМ в кинетику кальция в кардиомиоцитах, он существенным образом замедлял скорость спада кальциевого перехода и скорость механического расслабления (Рис. 1). Впервые показана зависимость влияния ОМ на сократимость миокарда от разных концентраций кальция в растворе омывающим препарат миокарда. Впервые показано влияние ОМ на степень выраженности, так называемого, медленного ответа силы (SFR) на ступенчатое удлинение миокарда, как аналога феномена Анрепа. В зависимости от концентрации кальция проявлялся как положительный, так и отрицательный инотропный эффект ОМ в здоровых и недостаточных сердцах. Наиболее ярким был отрицательный лузитропный эффект ОМ, в виде существенного замедления процесса расслабления изометрического сокращения (Рис. 1), что укорачивает длительность диастолического интервала, что ограничивает применение ОМ в клинической практике. Известно, что скорость процесса расслабления определяется, в значительной степени, скоростью секвестрации кальция саркоплазматическим ретикулюмом (внутриклеточная структура кардиомиоцита). Высказано предположение, что ускорение секвестрации сможет устранить этот недостаток ОМ и расширит применение его в клинической практике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РНФ №22-24-00729 (руководитель Копылова Г.В.)

Корректная сократительная функция миокарда требует строго упорядоченной и стабильной структуры саркомера миофибриллы. Белки семейства тропомодулинов/лейомодинов (Tmod и Lmod) участвуют в стабилизации саркомера и миофибриллогенезе. Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что Tmod и Lmod активируют тонкие нити и таким образом принимают участие в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Ochala et al., FASEB, 2014). Целью Проекта является исследование Tmod и Lmod в качестве новых факторов регуляции актин-миозинового взаимодействия в поперечно-полосатых мышцах. В 2022 г. исследовано участие изоформ Tmod1 и Tmod4 в активации тонких филаментов и регуляции актин-миозинового взаимодействия в миокарде.

 

Рис. 1. Влияние 500 нМ Tmod1 (А) и Tmod4 (Б) на кальциевую зависимость скорости скольжения тонких филаментов по миозину в in vitro подвижной системе. Кружками и квадратами обозначены экспериментальные значения, представленные как среднее ± стандартное отклонение. Кальциевая зависимость аппроксимирована уравнением Хилла.

 

Обнаружено, что характеристики полимеризации актина зависят как от изоформ тропомиозина, так и Tmod. Tmod дозо-зависимо снижал скорость скольжения филаментов по миозину в in vitro подвижной системе и усиливал мостик-мостиковую кооперативность взаимодействия F-актин–тропомиозиновых филаментов с миозином. Tmod1 и Tmod4 по-разному влияли на характеристики кальциевой регуляции актин-миозинового взаимодействия (рис. 1). Результаты экспериментов позволяют предположить, что тропомодулин влияет на подвижность тропомиозинового тяжа на актиновом филаменте. Таким образом, Tmod оказывает прямое влияние на актин-миозиновое взаимодействие и является одним из белков, участвующих в его регуляции в миокарде.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ПРОЕКТУ РФФИ №20-315-70006 (Мол-А) рук. Хохлова А.Д.

Целью проекта является исследование влияния локальной продукции эстрадиола на электрофизиологическую и сократительную функцию миокарда предсердий и желудочков на молекулярном и клеточном уровнях его организации. В первый год проекта использовалась модель гипоэстрогении, вызванной билатеральной овариэктомией (OVX) у самок крыс.

После OVX уменьшилась концентрация 17 β - эстрадиола в плазме крови крыс и увеличилась его локальная продукция по сравнению с ложнооперированной (Sham) группой. При помощи иммуногистохимического анализа показано повышение содержания ароматазы, фермента при помощи которого происходит внегонадная продукция 17 β - эстрадиола в OVX группе по сравнению с контролем.

Экспрессия ароматазы в ЛП и ПЖТ у Sham (А, В) и OVX (Б, Г) самок крыс, увеличение объектива 20х. Участки, содержащие ароматазу, окрашены бурым цветом.

В OVX группе амплитуда ауксотонического напряжения увеличилась в кардиомиоцитах ЛП, но уменьшилась в миоцитах ЛЖ.

В ЛЖ и ЛП по-разному изменилась степень фосфорилирования белков толстой и тонкой нитей, что может объяснять изменение характеристик сокращения одиночных кардиомиоцитов предсердий и желудочков.

Исследовано прямое действие эстрадиола на электромеханическое сопряжение и актин-миозиновое взаимодействие в одиночных кардиомиоцитах предсердий и желудочков интактных самок крыс. Уменьшение амплитуды сокращений кардиомиоцитов желудочков может быть связано с уменьшением степени фосфорилирования сердечного миозин-связывающего белка С.

 

Во второй год проекта использовалась модель легочной гипертензии, вызванной инъекцией монокроталина (MCT) у самок крыс. Отношение массы ПЖТ к массе тела уменьшалось у MCT животных. Степень выраженности реактивных изменений в миокарде значительно неоднородна в группе MCT с выраженной клеточной реакцией и гипертрофией правых отделов сердца. Содержание эстрадиола в гомогенатах миокарда, ПЖТ и плазме крови не различалось между группами. Иммуногистохимический анализ показал, что в группе MCT содержание ароматазы уменьшилось в перикардиальных белых адипоцитах по сравнению с контролем.

Экспрессия ароматазы в белых адипоцитах перикардиальной жировой ткани интактных самок (А) и при легочной гипертензии (Б). Участки, содержащие ароматазу, окрашены бурым цветом, увеличение объектива 100х.

В MCT группе уменьшается амплитуда напряжения и ухудшается длинозависимая активация миофиламентов кардиомиоцитов ПЖ. У MCT животных изменились характеристики кальциевой регуляции актин-миозинового взаимодействия в ПЖ, ПП и МжП, что может объясняться изменением степени фосфорилирования белков саркомера.

Тропомиозин (Tpm) – альфа-спиральный белок, который входит в состав тонких нитей саркомеров поперечно-полосатых мышц и участвует в регуляции сокращения. Известно более 30 мутаций в гене, кодирующем сердечный Tpm (TPM1), которые ассоциированы с развитием тяжелых наследственных заболеваний сердца человека. Целью проекта является сравнение структурно-функциональных свойств альфа- и каппа-тропомиозина (Tpm1.1 и Tpm1.2, соответственно), несущих точечные мутации L113V, I130V, D159N, R160H и S229F, ассоциированные с развитием некомпактной кардиомиопатии левого желудочка и пороками развития сердца.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

• С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) изучено влияние мутаций на доменную структуру Tpm1.1 и Tpm1.2. Обнаружено, что все исследованные мутации влияли на доменную структуру Tpm1.1 и Tpm1.2 (рис. 1).
• Влияние мутаций на взаимодействие Tpm с актином исследовано с помощью соосаждения с гель-электрофорезом. В Tpm1.1 мутации I130V и D159N уменьшали сродство тропомиозина к актину, а остальные мутации не влияли на него. Мутации I130V, D159N и S229F снижали сродство Tpm1.2 к актину (рис. 2).
• Для исследования влияния мутаций на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия в предсердиях мы проанализировали Са2+ зависимость скорости скольжения тонких филаментов, содержащих Tpm с мутациями, по миозину предсердий в ИПС. Все мутации в Tpm1.1, влияли на характеристики Са2+ зависимости скорости филаментов. Мутации L113V и D159N в Tpm1.1 уменьшали, а I130V и S229F увеличивали максимальную скорость скольжения филаментов по миозину предсердий. Мутации I130V, D159N и R160H уменьшали Са2+ чувствительность скорости. Только одна мутация в Tpm1.2 влияла на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия: I130V мутация понижала максимальную скорость скольжения филаментов по миозину предсердий в ИПС (рис. 3).
• В результате моделирования молекулярной динамики обнаружено, что мутация L113V вызывает изменения структурных свойств молекул Tpm1.1 и Tpm1.2, в том числе в участках, удалённых от места внесения аминокислотной замены (рис. 4).
• Таким образом, изменения структуры молекулы Tpm1.1 вследствие НМЛЖ мутаций приводят к нарушению актин-миозинового взаимодействия в предсердиях.

Рис. 1 Кривые теплопоглощения WT Tpm1.2 и Tpm1.2 с НМЛЖ мутациями, полученные с помощью метода ДСК. Домен 2 соответствует С-концевой части молекулы, домен 3 – N-концевой части, а домен 1 соответствует плавлению наименее упорядоченных участков (центральной части и зоны перекрытия N- и С-концов соседних молекул тропомиозина).

Рис. 2 Влияние мутаций тропомиозина на его аффинность к актину.

Рис. 3 Влияние мутаций Tpm1.1 на кальциевую зависимость скорости скольжения тонких филаментов по миозину предсердий в in vitro подвижной системе. Экспериментальные данные аппроксимированы уравнением Хилла: V = Vmax×(1+10h(pCa-pCa50))-1, где V и Vmax – скорость и максимальная скорость скольжения нитей при насыщающей концентрации кальция, соответственно, pCa50 (чувствительность к кальцию) – это рСа, при котором достигается полумаксимальная скорость, а h – коэффициент Хилла.

 

Рис. 4 Оценка изгибной жесткости молекул WT Tpm1.1, WT Tpm1.2 и c мутацией L113V по результатам молекулярно-динамического (МД) моделирования. Жесткость оценивали с помощью метода, описанного в работах [Matyushenko et al., FEBS J, 2018; Koubassova et al., Intl J Mol SCi, 2018], по зависимости среднестатистического изгиба оси суперспирали от расстояния s от N-конца молекулы Трm (In((s(s),(t(s)))) от s для изоформ Tpm; s - расстояние вдоль оси супер-спирали Трт от N-конца молекулы; t - единичный вектор, касательный к оси супер-спирали; <…> - среднее значение за время МД расчёта). Чем меньше наклон этой зависимости, тем выше изгибная жёсткость молекулы Tpm [Matyushenko et al., FEBS J, 2018].