Тропомиозин (Tpm) – альфа-спиральный белок, который входит в состав тонких нитей саркомеров поперечно-полосатых мышц и участвует в регуляции сокращения. Известно более 30 мутаций в гене, кодирующем сердечный Tpm (TPM1), которые ассоциированы с развитием тяжелых наследственных заболеваний сердца человека. Целью проекта является сравнение структурно-функциональных свойств альфа- и каппа-тропомиозина (Tpm1.1 и Tpm1.2, соответственно), несущих точечные мутации L113V, I130V, D159N, R160H и S229F, ассоциированные с развитием некомпактной кардиомиопатии левого желудочка и пороками развития сердца.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
- С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) изучено влияние мутаций на доменную структуру Tpm1.1 и Tpm1.2. Обнаружено, что все исследованные мутации влияли на доменную структуру Tpm1.1 и Tpm1.2 (рис. 1).
- Влияние мутаций на взаимодействие Tpm с актином исследовано с помощью соосаждения с гель-электрофорезом. В Tpm1.1 мутации I130V и D159N уменьшали сродство тропомиозина к актину, а остальные мутации не влияли на него. Мутации I130V, D159N и S229F снижали сродство Tpm1.2 к актину (рис. 2).
- Для исследования влияния мутаций на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия в предсердиях мы проанализировали Са2+ зависимость скорости скольжения тонких филаментов, содержащих Tpm с мутациями, по миозину предсердий в ИПС. Все мутации в Tpm1.1, влияли на характеристики Са2+ зависимости скорости филаментов. Мутации L113V и D159N в Tpm1.1 уменьшали, а I130V и S229F увеличивали максимальную скорость скольжения филаментов по миозину предсердий. Мутации I130V, D159N и R160H уменьшали Са2+ чувствительность скорости. Только одна мутация в Tpm1.2 влияла на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия: I130V мутация понижала максимальную скорость скольжения филаментов по миозину предсердий в ИПС (рис. 3).
- В результате моделирования молекулярной динамики обнаружено, что мутация L113V вызывает изменения структурных свойств молекул Tpm1.1 и Tpm1.2, в том числе в участках, удалённых от места внесения аминокислотной замены (рис. 4).
- Таким образом, изменения структуры молекулы Tpm1.1 вследствие НМЛЖ мутаций приводят к нарушению актин-миозинового взаимодействия в предсердиях.
Рис. 1 Кривые теплопоглощения WT Tpm1.2 и Tpm1.2 с НМЛЖ мутациями, полученные с помощью метода ДСК. Домен 2 соответствует С-концевой части молекулы, домен 3 – N-концевой части, а домен 1 соответствует плавлению наименее упорядоченных участков (центральной части и зоны перекрытия N- и С-концов соседних молекул тропомиозина).
Рис. 2 Влияние мутаций тропомиозина на его аффинность к актину.
Рис. 3 Влияние мутаций Tpm1.1 на кальциевую зависимость скорости скольжения тонких филаментов по миозину предсердий в in vitro подвижной системе. Экспериментальные данные аппроксимированы уравнением Хилла: V = Vmax×(1+10h(pCa-pCa50))-1, где V и Vmax – скорость и максимальная скорость скольжения нитей при насыщающей концентрации кальция, соответственно, pCa50 (чувствительность к кальцию) – это рСа, при котором достигается полумаксимальная скорость, а h – коэффициент Хилла.
Рис. 4 Оценка изгибной жесткости молекул WT Tpm1.1, WT Tpm1.2 и c мутацией L113V по результатам молекулярно-динамического (МД) моделирования. Жесткость оценивали с помощью метода, описанного в работах [Matyushenko et al., FEBS J, 2018; Koubassova et al., Intl J Mol SCi, 2018], по зависимости среднестатистического изгиба оси суперспирали от расстояния s от N-конца молекулы Трm (In((s(s),(t(s)))) от s для изоформ Tpm; s - расстояние вдоль оси супер-спирали Трт от N-конца молекулы; t - единичный вектор, касательный к оси супер-спирали; <…> - среднее значение за время МД расчёта). Чем меньше наклон этой зависимости, тем выше изгибная жёсткость молекулы Tpm [Matyushenko et al., FEBS J, 2018].