Грант РНФ №22-24-00729 "Роль тропомодулина и лейомодина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в поперечно-полосатых мышцах"
2022-2023г.
Руководитель: Копылова Г.В.
ЕГИСУ НИОКР 122051100120-5
Корректная сократительная функция миокарда и скелетных мышц требует строго упорядоченной и стабильной структуры саркомера миофибриллы. К основным белкам саркомера, определяющих его стабильность и участвующих в миофибриллогенезе, относятся белки семейства тропомодулинов/лейомодинов (Tmod и Lmod). Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что Tmod и Lmod активируют тонкие нити и таким образом принимают участие в регуляции актин-миозинового взаимодействия (Ochala et al., FASEB, 2014). Целью Проекта является исследование тропомодулина и лейомодина в качестве новых факторов регуляции актин-миозинового взаимодействия в поперечно-полосатых мышцах.
Исследовано влияние Tmod1 на стабильность актин-тропомиозинового комплекса. Для этого проанализированы температурные зависимости диссоциации Tpm с поверхности актинового филамента в присутствии Tmod1 путем измерения светорассеяния. Обнаружено, что Tmod1 слегка усиливал термостабильность F-актин-тропомиозинового комплекса. С помощью светорассеивания изучено влияние изоформ Tmod1 и Tmod4 на полимеризацию актина в присутствии изоформ тропомиозина Tpm1.1 и Tpm1.2. Добавление обеих изоформ тропомиозина усиливало полимеризацию, уменьшая время полимеризации 50 % белка, что согласуется с ранее полученными данными.
В оптической ловушке измерена изгибная жесткость актин-тропомиозиновых филаментов, реконструированных из актина, тропонинового комплекса и изоформ тропомиозина, в отсутствие изоформ Tmod1, Tmod3 и Tmod4 и при их добавлении. Наличие регуляторных белков тропонина и тропомиозина на актиновой нити увеличивало изгибную жёсткость F-актина, что согласуется с ранее полученными данными (Nabiev et al., Biophysical Journal, 2015). Обнаружено, что изоформы тропомодулина по-разному влияют на изгибную жёсткость тонкой нити, и эффект этот зависит от изоформ тропомиозина. Полученные результаты говорят о том, что взаимодействие разных изоформ тропомодулина с тропомиозином отличается. Ранее было показано, что изоформы Tmod1 и Tmod3 с разной аффинностью связывают изоформы немышечных тропомиозинов и альфа-тропомиозин (Yamashiro et al., The Journal of biological chemistry, 2014). Аминокислотная последовательность N-терминальной части изоформ Tmod1 и Tmod4 имеет значительные отличия (Greenfield et al., Biophysical Journal, 2005), что определяет особенности взаимодействия тропомодулина с тропомиозином.
Используя in vitro подвижную систему (ИПС), исследовано влияние изоформ Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в миокарде, а также быстрых и медленных скелетных мышцах. Для исследования влияния Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в миокарде использовали сердечный миозин из левого предсердия и желудочка овцы, Tpm1.1 и Tpm1.2 человека, а также сердечный тропониновый комплекс человека. В саркомере миокарда экспрессируется Tmod1, поэтому мы исследовали его влияние на взаимодействие сердечных белков. В некоторых экспериментах мы сравнили эффекты Tmod1 и Tmod4, использовав последний в качестве модели тропомодулина с другой аминокислотной последовательностью сайтов связывания тропомозина.
В быстрых и медленных скелетных мышцах экспрессируется специфический спектр изоформ миозина, тропонина и тропомиозина. Поэтому для исследования влияния Tmod на актин-миозиновое взаимодействие в медленных мышцах мы использовали миозин и тропониновый комплекс, выделенные из медленной скелетной (m. soleus) мышцы кролика, с Tpm3.12, а также с гетеродимером Tpm2.2/Tpm3.12; а в быстрых мышцах – миозин и тропониновый комплекс, выделанные из быстрой скелетной мышцы (m. psoas) кролика, с Tpm1.1 и Tpm3.12. В саркомере скелетных мышц экспрессируются Tmod1 и Tmod4, а при нокауте гена TMOD1 вместо Tmod1 экспрессировались Tmod3 и Tmod4 (Ochala et al., FASEB, 2014). Поэтому мы сравнили влияние Tmod1, Tmod3 и Tmod4 на актин-миозиновое взаимодействие в скелетных мышцах.
Для оценки влияния Tmod на скорость скольжения актинового филамента измерили скорость F-актина при концентрациях Tmod от 50 нМ до 1000 нМ. Обнаружено, что тропомодулин не влияет на скорость скольжения F-актина по миозину в ИПС, что говорит об отсутствии его неспецифического взаимодействия с актином. Влияние Tmod на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия изучали, анализируя кальциевую зависимость скорости скольжения регулируемых тонких филаментов, реконструированных из актина, тропонина и тропомиозина, по миозину в ИПС (зависимость рСа-скорость). Для исследования влияния Tmod на активацию тонких филаментов поперечными мостиками миозина (мостик-мостиковая кооперативность) проанализирована зависимость скорости скольжения филаментов от концентрации миозина, загружаемого в проточную ячейку.
Обнаружено, что изоформы Tmod по-разному активируют тонкий филамент через механизм мостик-мостиковой кооперативности и влияют на характеристики взаимодействия изоформ сердечного и скелетного миозина с актином, а также на параметры кальциевой регуляции этого взаимодействия (максимальную скорость скольжения тонких филаментов и кальциевую чувствительность актин-миозинового взаимодействия). Эффекты Tmod на характеристики кальциевой регуляции актин-миозинового взаимодействия зависели также от изоформ тропомиозина.
В результате выполнения Проекта удалось установить особенности взаимодействия изоформ Tmod с актином и тропомиозином в сердечной и скелетной мышцах. Полученные результаты однозначно указывают на участие тропомодулина в активации тонких филаментов как в скелетных мышцах, так и миокарде, и позволяют сделать вывод о том, что тропомодулин относится к регуляторной системе тонких филаментов. Кроме того, результаты экспериментов с миокардиальными белками крысы говорят о том, что тропомодулин участвует в молекулярных механизмах адаптации сократительной функции сердца у млекопитающих с разной частотой сердечных сокращений.